Mesophile und thermophile Viren werden mit dem Nährstoffkreislauf während der hyperthermophilen Kompostierung in Verbindung gebracht

The ISME Journal Band 17, Seiten 916–930 (2023)Zitieren Sie diesen Artikel

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Details zu den Metriken

Während der Abbau organischer Stoffe durch Bakterien eine wichtige Rolle im Nährstoffkreislauf in terrestrischen Ökosystemen spielt, ist die Bedeutung von Viren noch immer kaum verstanden. Hier haben wir Metagenomik und Metatranskriptomik mit zeitlicher Probenahme kombiniert, um die Bedeutung mesophiler und thermophiler Bakterien und ihrer Viren für den Nährstoffkreislauf während der hyperthermophilen Kompostierung (HTC) im industriellen Maßstab zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Dynamik und Aktivität der Virus-Bakterien-Dichte eng miteinander verbunden ist, wobei für mesophile und thermophile Bakterien spezifische Viren ihre Wirtsdichten verfolgen und so die Nachfolge mikrobieller Gemeinschaften über Top-Down-Kontrolle während der HTC auslösen. Darüber hinaus kodierten und exprimierten Viren, die für mesophile Bakterien spezifisch sind, mehrere zusätzliche Stoffwechselgene (AMGs), die mit dem Kohlenstoffkreislauf in Verbindung stehen und neben Bakterien auch den Nährstoffumsatz beeinflussen. Der Nährstoffumsatz korrelierte positiv mit dem Virus-Wirt-Verhältnis, was auf einen positiven Zusammenhang zwischen der Ökosystemfunktion, der Virushäufigkeit und der Virusaktivität hinweist. Diese Effekte wurden überwiegend durch DNA-Viren verursacht, da die meisten nachgewiesenen RNA-Viren mit Eukaryoten und nicht mit dem Nährstoffkreislauf während der thermophilen Phase der Kompostierung in Zusammenhang standen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass DNA-Viren den Nährstoffkreislauf während der HTC vorantreiben könnten, indem sie bakterielle Biomasse durch Zelllyse recyceln und wichtige AMGs exprimieren. Viren könnten daher möglicherweise als Indikatoren für die Funktion mikrobieller Ökosysteme verwendet werden, um die Produktivität biotechnologischer und landwirtschaftlicher Systeme zu optimieren.

Der Abbau organischer Stoffe ist ein wichtiger Ökosystemprozess, der sich auf den Nährstoffkreislauf und die Produktivität in terrestrischen Ökosystemen auswirkt [1]. Während bekannt ist, dass sowohl Bakterien- als auch Pilzgemeinschaften eine entscheidende Rolle beim Recycling von Nährstoffen über den „Mikrobenkreislauf“ spielen [1], ist die Rolle bakterieller Viren, also Bakteriophagen (Phagen), noch wenig verstanden [2]. Als am häufigsten vorkommende biologische Einheit auf der Erde spielen Viren eine entscheidende Rolle bei der Steigerung der mikrobiellen Sterblichkeit durch Zelllyse [3, 4], indem sie den Elementkreislauf über die Freisetzung von Nährstoffen erheblich beeinflussen und die Zusammensetzung, Diversität und mikrobielle Nekromasse der mikrobiellen Gemeinschaft beeinflussen [5,6, 7,8,9,10]. Während die Bedeutung von Viren für den Nährstoffkreislauf in den Ozeanen gut belegt ist [11], beginnen wir erst zu verstehen, wie Viren den Nährstoffumsatz und die Mineralisierung organischer Stoffe in Böden modulieren [9, 10, 12]. Es wurde gezeigt, dass viruskodierte Hilfsstoffwechselgene (AMGs), die mit Glykosidhydrolasen und dem Methanstoffwechsel assoziiert sind, zum Kohlenstoffkreislauf in Bodenökosystemen beitragen [4, 6, 13]. Beispielsweise weisen 14 AMGs, darunter 9 Glycosid-Hydrolase-Familien, wie z. B. Endomannanase mit bestätigter funktioneller Aktivität, darauf hin, dass Viren potenziell in der Lage sind, am komplexen Kohlenstoffabbau teilzunehmen [4]. Kürzlich wurde gezeigt, dass Viren nicht nur den Nährstoffkreislauf über die Lyse von Bakterienzellen im Boden vorantreiben, sondern auch das Überleben ihrer Wirtsbakterien unter Umweltstress verbessern, indem sie Hilfsstoffwechselgene (AMGs) kodieren, die die Stoffwechselkapazität von Bakterienwirten steigern [14]. Trotz dieser jüngsten Fortschritte haben wir immer noch ein begrenztes Verständnis darüber, wie Viren und Bakterien gemeinsam den Nährstoffkreislauf und die Zersetzung organischer Stoffe in terrestrischen Ökosystemen vorantreiben [15].

Hier verwendeten wir eine hyperthermophile Kompostierung (HTC) als Modellsystem, um die Rolle mesophiler und thermophiler Bakterien und ihrer Viren bei der Zersetzung organischer Stoffe zu untersuchen. HTC ist eine Abfallbehandlungstechnologie, die zum Abbau der organischen Fraktion kommunaler oder landwirtschaftlicher Feststoffabfälle eingesetzt wird und extrem hohe Temperaturen (bis zu 90 °C) ohne exogene Erwärmung aufgrund der Aktivität der thermophilen Bakteriengemeinschaft erreicht [16,17,18]. HTC umfasst drei Haupttemperaturphasen: hyperthermophil (>80 °C), thermophil (>50 °C) und Reifungsphase (Umgebungstemperatur). Dabei werden mit Kohlenstoff und Stickstoff angereicherte Polymersubstanzen (Lignozellulose, Proteine, Polysaccharide und Lipide) während der thermophilen Phasen der Kompostierung abgebaut, während sich langsam abbauende, mit Huminstoffen angereicherte Verbindungen während der Reifungsphase abbauen. Die Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften, die den Abbau organischer Stoffe vorantreiben, ändert sich dynamisch entsprechend der Kompostierungstemperatur während der HTC [19], und thermophile, hitzebeständige Taxa (Firmicutes; Bacillus und Deinococcota; Thermus) sind wichtig für den Abbau organischer Stoffe während der HTC thermophile Phase [16]. Während die Auswirkungen von Temperatur, Rohstoffen und physikalisch-chemischen Kompostierungseigenschaften in Bezug auf den Aufbau mikrobieller Gemeinschaften und den Abbau organischer Stoffe ausführlich untersucht wurden (20, 21), ist über die Rolle von Viren bei HTC nur sehr wenig bekannt.

Viren könnten während der HTC auf zwei Arten Auswirkungen auf Bakterien haben. Erstens könnten sie die Bakterienhäufigkeit durch Lyse stark von oben nach unten kontrollieren, wie in aquatischen Systemen gezeigt wurde [22]. Eine solche virale Prädation könnte den Nährstoffkreislauf aus bakterieller Biomasse beeinflussen [8, 9], die ökologische Abfolge von mesophilen und thermophilen Taxa während der HTC vorantreiben und möglicherweise die Bakterienvielfalt im Laufe der Zeit fördern, indem Dominanzeffekte über das „Kill-the-Winner“-Modell reduziert werden [23]. , 24]. Zweitens könnten Viren den Nährstoffkreislauf durch die Bereitstellung funktioneller Gene, die mit dem Abbau verbunden sind, vorantreiben. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass virale AMGs möglicherweise Wirtsbakterien dabei helfen können, Nährstoffe aufzunehmen und toxische Verbindungen abzubauen, was sich positiv auf ihr Überleben auswirkt [14]. Da Viren für die Transkription ihrer Gene eine Wirtszellmaschinerie benötigen, kann die auf Transkriptomik basierende Virusaktivität verwendet werden, um eine erfolgreiche Infektion von Wirten anzuzeigen [25]. Dieser Ansatz wurde kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass Sedimente unter dem Meeresboden sowohl Aktivität durch lytische als auch lysogene Viren zeigen [26] und dass die Expression von AMGs möglicherweise an der Modulation des Methan- und Schwefelstoffwechsels des Wirts bei Infektion im Meeresökosystem beteiligt ist [22, 27]. und dass Riesenviren im küstennahen Meeressystem aktiv sind [28]. Hier wählten wir mikrobenreiches HTC als Modellsystem, um die Zusammensetzung, Diversität und Aktivität der Bakterien- und Virusgemeinschaft in Bezug auf den Kohlenstoff- und Stickstoffumsatz zu bewerten [16]. Da HTC typischerweise durch eine zeitabhängige Abfolge mikrobieller Gemeinschaften gekennzeichnet ist, haben wir außerdem speziell die Rolle mesophiler und thermophiler Bakterien und ihrer DNA-Viren in der Dynamik des Nährstoffkreislaufs verglichen.

In dieser Studie verwendeten wir ein hyperthermophiles Kompostierungsexperiment im industriellen Maßstab, um eine replizierte, zeitliche Stichprobe der Zusammensetzung der Bakterien-Viren-Gemeinschaft, ihrer Häufigkeit, ihres funktionellen Geninhalts und ihrer Aktivität auf der Grundlage von Metagenomik und Metatranskriptomik zu erstellen. Wir fanden heraus, dass die Dynamik und Aktivität der Virus-Bakterien-Dichte gekoppelt ist, wobei für mesophile und thermophile Bakterien spezifische Viren ihre Wirtsdichten verfolgen, was auf eine starke Top-Down-Kontrolle des Virus während der HTC hindeutet. Diese Effekte wurden überwiegend durch DNA-Viren verursacht, da die Mehrheit der nachgewiesenen RNA-Viren (82 %) mit Eukaryoten assoziiert und während der thermophilen Phase der Kompostierung vom Nährstoffkreislauf abgekoppelt waren. Darüber hinaus kodierten und exprimierten DNA-Viren, die für mesophile Bakterien spezifisch sind, mehrere AMGs, die mit dem Kohlenstoffkreislauf in Verbindung stehen und zusammen mit Bakterien den Nährstoffumsatz beeinflussen. Infolgedessen korrelierten die Virushäufigkeit und -aktivität positiv mit dem Nährstoffkreislauf, was die Bedeutung von Viren für den Abbau organischer Stoffe während der HTC hervorhebt.

Das Kompostierungsexperiment wurde in einer voll ausgestatteten hyperthermophilen Kompostierungsanlage im Bezirk Shunyi, Peking, China (40°03′10.48″N, 116°56′2.12″E) durchgeführt. Als Hauptkompostierungsrohstoffe wurden Klärschlamm und Reisschalen verwendet, wie in einer früheren Studie beschrieben [16]. Die hyperthermophile Kompostierung dauert normalerweise 45 Tage vom Beginn bis zum Abschluss und umfasst vier Temperaturphasen: Anfangsphase (Tag 1: 32 °C), hyperthermophile Phase (von Tag 2 bis 9: >90 °C), thermophile Phase (von Tag 10 bis 26). : >55 °C) und Reifephase (von Tag 27 bis 45: <45 °C). Um Veränderungen während des gesamten Kompostierungsprozesses abzudecken, wurden acht Proben von fünf Komposthaufen in verschiedenen Phasen der hyperthermophilen Kompostierung an den Tagen 0 (D0), 4 (D4), 7 (D7), 9 (D9), 15 (D15) gesammelt. 21 (D21), 27 (D27), 33 (D33) und 45 (D45). Um gut verteilte und homogenisierte Proben zu erhalten, wurde jeder Haufen diagonal in fünf Domänen unterteilt und jede Domäne wurde an derselben Stelle in einer Tiefe von 40–50 cm zu unterschiedlichen Probenahmezeitpunkten beprobt. Innerhalb jedes Stapels wurden fünf Teilproben (jeweils 5000 g) pro Domäne gesammelt und dann zu einer einzigen zusammengesetzten Probe gemischt, die weiter in zwei Aliquots aufgeteilt wurde. Ein Replikat-Aliquot wurde für biologische Analysen in flüssigem Stickstoff gelagert und das andere für physikalisch-chemische Analysen bei 4 °C aufbewahrt. Zur Bestimmung der Temperaturveränderungen während der Kompostierung wurde ein automatischer Temperaturregler eingesetzt.

Änderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Komposts wurden mit zuvor beschriebenen Methoden gemessen [16], sofern nicht anders angegeben. Der Kohlenstoffkreislauf wurde anhand des Gesamtkohlenstoffgehalts (TC), des wasserlöslichen Kohlenstoffs (WSC), des Gesamtgehalts an organischem Kohlenstoff (TOC) und des Gehalts an anorganischem Kohlenstoff (IC) bewertet. Der Stickstoffkreislauf wurde anhand des Gesamtstickstoffgehalts (TN), der Konzentrationen an wasserlöslichem Stickstoff (WSN), Ammonium (NH4+) und Nitrat (NO3−) quantifiziert. TOC und IC wurden mit einem automatischen TOC-Analysator für flüssige Proben (Shimadzu TOC-L CPH, Kyoto, Japan) quantifiziert, während TN und TC mit einem Elementar-Gerät (Vario MAX Cube, Hanau, Deutschland) unter Verwendung trockener Verbrennung bestimmt wurden. Der Gehalt an organischer Substanz (OM) wurde durch 8-stündige Trockenverbrennung bei 550 °C gemessen. Die TN- und TC-Werte wurden zur Berechnung des C/N-Verhältnisses verwendet. Zu den weiteren gemessenen physikalisch-chemischen Eigenschaften gehörten pH-Wert, Wassergehalt (WC) und elektrische Leitfähigkeit (EC). Die Konzentration von WSN basierte auf der Summe der NH4+- und NO3−-Gehalte, während die WSC-Konzentration auf der Summe von TOC und IC basierte.

Um Veränderungen in der Zusammensetzung und Diversität der Bakteriengemeinschaft während der Kompostierung zu bestimmen, wurden alle gesammelten Proben (jeder Zeitpunkt bestehend aus 5 Replikaten) einer 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung unter Verwendung einer NovaSeq6000-Plattform (Illumina, PE250-Modus, Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd, Guangzhou, China). Die gesamte genomische DNA für die Amplikonsequenzierung wurde unter Verwendung eines DNeasy PowerSoil-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Es wurden die Prokaryoten-Primer (Bakterien und Archaeen) 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) und 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′) verwendet, die auf die V4-V5-Region des 16S-rRNA-Gens abzielen. Die rohen 16S-rRNA-Gensequenzen wurden mit QIIME 2 (Version 2019.7) [29] verarbeitet und qualitätsgefiltert (d. h. gefiltert, derepliziert, entrauscht, zusammengeführt und auf Chimären untersucht), um mithilfe der DADA2-Pipeline Amplikonsequenzvarianten (ASVs) zu erzeugen QIIME2 [30]. Die Kürzungs- und Trimmparameter in DADA2 wurden auf –p-trim-left-f 0, –p-trim-left-r 0; und –p-trunc-len -f 248, –p-trunc-len-r 230. Die von DADA2 generierte Merkmalstabelle wurde gefiltert, um ASVs mit einer Häufigkeit von weniger als zwei zu entfernen, und die verbleibenden ASVs wurden mit dem naiven Bayes-Klassifikator QIIME2 klassifiziert geschult auf 99 % operativer taxonomischer Einheiten, die in der SILVA-rRNA-Datenbank verfügbar sind (Version 138) [31]. Die mikrobielle Diversität wurde mithilfe der Alpha-Diversität (Shannon-Index und beobachtete OTU) und die Zusammensetzung der Gemeinschaft mithilfe der Beta-Diversität (gewichtete UniFrac-Distanz) basierend auf der Q2-Diversity-Pipeline innerhalb von QIIME2 geschätzt. Um den Community-Assembly-Prozess zu quantifizieren, wurde eine Nullmodellanalyse verwendet, um den Community-Assembly-Mechanismus zu erkennen, indem die Standardabweichung zwischen dem beobachteten ökologischen Modell und dem zufällig generierten ökologischen Modell berechnet wurde [32, 33].

Drei zufällig ausgewählte Kompostreplikatproben wurden für die DNA- und RNA-Shotgun-Sequenzierung an den Tagen 0, 4, 15 und 27 der Kompostierung ausgewählt, die jeweils die Erhitzungs-, Hyperthermophilie-, Thermophilie- und Reifungsphase der Kompostierung darstellten (was zu insgesamt 12 Metatranskriptomen führte). und 12 Metagenomproben). Eine Teilmenge jeder Replikatprobe wurde für die DNA-Extraktion verwendet, um die Gewinnung von Metagenome-Assembled Genomes (MAGs) zu verbessern, während die andere für die Gesamt-RNA-Extraktion verwendet wurde, um die Genexpression auf Gemeinschaftsebene mithilfe von Metatranskriptomik zu untersuchen. Vor der RNA-Extraktion wurden die Proben sofort in RNAlater (ThermoFisher Scientific) und flüssigem Stickstoff gelagert. Die gesamte genomische DNA und RNA wurden aus 0,5 g Kompostproben unter Verwendung des DNeasy PowerSoil-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) bzw. des RNeasy PowerSoil-Gesamt-RNA-Kits (Qiagen) gemäß den Protokollen der Hersteller extrahiert. Die Proben wurden vor der metagenomischen Verarbeitung nicht gefiltert und enthielten daher sowohl frei lebende Viren als auch intakte Prophagen. Die DNA-Qualität wurde mit einem 1 %igen Agarosegel bewertet und die DNA-Konzentration wurde mit hochempfindlichen Qubit-dsDNA-Assays (Thermo Fisher, Waltham, USA) gemessen. Die RNA-Konzentrationen wurden mit dem Qubit RNA HS-Assay-Kit gemessen und die RNA-Integrität mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) vor und nach der rRNA-Entfernung mit dem Ribo-minus Transcriptome Isolation Kit (Thermo Fisher, Waltham, USA) bestimmt. Die resultierende angereicherte mRNA wurde für die Sequenzierung unter Verwendung des TruSeq-Vorbereitungskits für gestrandete mRNA-Bibliotheken (Illumina, Kalifornien, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers vorbereitet. Die extrahierte DNA und cDNA aus jeder Probe wurden zum Aufbau von Bibliotheken (300 bp) bei Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd. verwendet. Die Bibliotheken wurden mit dem DNA Library Prep Kit V2 für Illumina (Illumina, Kalifornien, USA) nach dem Protokoll des Herstellers vorbereitet, das kompatibel ist mit der gesamten DNA, einschließlich dsDNA. Während dieses Kit die meisten ssDNA-Viren entfernt, verbleibt wahrscheinlich ein kleiner Teil der ssDNA-Viren, die als dsDNA oder dsDNA-Zwischenprodukte aus der aktiven Replikation in das Bakteriengenom eingebaut wurden, in unseren Bibliotheken [34]. Die Sequenzierung wurde mit der NovaSeq6000-Plattform (Illumina, PE150-Modus, Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd) durchgeführt. Die detaillierten Informationen zu den DNA- und RNA-Sequenzierungsdatensätzen sind in Tabelle S7 zusammengefasst.

Alle DNA-Sequenzen wurden mit Trimmomatic gekürzt, um Illumina-Adapter zu entfernen und qualitativ hochwertige Lesevorgänge beizubehalten (v 0,39, Score >30 und Länge >36 Basen) [35]. Alle hochwertigen Sequenzen wurden mit SPAdes v3.13.1 mit den Parametern „-k 33, 55, 77, 99, 111,127 --meta“ zusammengefügt [36]. Wir haben auch Lesevorgänge, die in jeder thermischen Phase der Kompostierung separat generiert wurden (kompostierungsphasenspezifische Baugruppen), unter Verwendung von SPAdes mit denselben Parametern zusammengestellt. Alle zusammengesetzten Gerüste, die länger als 2,0 kb sind, wurden mithilfe von Metawrap [37] basierend auf MetaBAT2 [38], MaxBin2 [39] und Concoct [40] mit Standardparametern gruppiert. Mithilfe des Bin_refinement-Moduls in Metawrap wurden die Bins weiter manuell kuratiert, um qualitativ hochwertige Genome zu erhalten (37). Die Vollständigkeit und Kontamination von Genombehältern wurde mit CheckM v1.0.13 bewertet (41), und metagenomassemblierte Genome (MAGs) mit einer Vollständigkeit von mehr als 50 % und einem Kontaminationsgrad von weniger als 10 % wurden für weitere Analysen aufbewahrt. Bins aus verschiedenen Proben wurden derepliziert, um mit dRep v.2.3.2 (42) Genome mittlerer bis hoher Qualität zu erzeugen, und mithilfe des GTDB-Tk-Toolkits (v .0.3.2) mit dem Klassifizierungsworkflow [43]. Um bakterielle MAGs zu konstruieren, wurden Gene mit Prodigal mit den Parametern „-p meta“ [44] aufgerufen und mit dem Diamond-Tool [45] anhand der KEGG- und Pfam-Datenbanken annotiert. Die vorhergesagten Proteine ​​wurden mit dem hmmscan-Modul von HMMER v3.2.1 und der dbCAN-Datenbank auf Kandidaten-CAZymes untersucht (Grenzwerte: Abdeckungsfraktion: 0,40; E-Wert: 1e-18) [46]. Gene, die für Proteasen und Peptidasen kodieren, wurden mithilfe von Diamond anhand der MEROPS-Datenbankversion 12.0 identifiziert (Grenzwerte: E-Wert 1e-20 – Beschleunigung 0,8). Ribosomale RNAs wurden mit RNAmmer v1.2 vorhergesagt [47]. Die optimale Wachstumstemperatur (OGT) von MAGs wurde durch die Methode des maschinellen Lernens unter Verwendung von Tome v1.1 vorhergesagt [48]. Thermophile MAGs wurden als solche mit einem OGT ≥ 50 °C definiert, während MAGs als mesophil eingestuft wurden, wenn ihr OGT < 50 °C war. Um phylogenetische MAG-Bäume zu erstellen, wurde der „Klassifizierungs“-Workflow in GTDB-Tk (v.0.3.2; Standardeinstellungen) verwendet, um 120 bakterielle Markergene zu identifizieren, die für die Baumkonstruktion basierend auf der Ausrichtung mehrerer Sequenzen verwendet wurden. Die resultierenden FASTA-Dateien, die mehrere Sequenzausrichtungen der eingereichten Genome enthielten, wurden für die phylogenetische Bauminferenz mit maximaler Wahrscheinlichkeit unter Verwendung von FastTree v.2.1.10 mit den Standardparametern verwendet (49). Die Ausgabedateien des Newick-Baums wurden mit iTOL v.5 visualisiert [50].

Um Viren mit hoher Sicherheit zu identifizieren, wurden virale Contigs, die größer als 5 kb waren, aus Metagenom-Assemblies gewonnen und mithilfe einer Kombination aus drei Tools mit strengen Qualitätsschwellenwerten analysiert, wie zuvor vorgeschlagen [51]. Zunächst wurde DeepVirFinder v1.0 [52] mit einem lockeren Cutoff (Score 0,7 und p < 0,05) ausgeführt, um maximale Empfindlichkeit zum Nachweis viraler Sequenzen zu erreichen. Zweitens wurde VirSorter2 v2.2.1 [53] verwendet, um die mutmaßlichen Virussequenzen mit Werten ≥ 0,95 zu identifizieren, wobei DeepVirFinder-Ausgabesequenzen als Eingabedateien verwendet wurden. Um einige nicht-virale Sequenzen während der VirSorter2-Analyse zu entfernen, wurde CheckV (v0.9.0)[54] zur Qualitätsbewertung verwendet. Der endgültige Virus-Contig-Datensatz wurde manuell kuratiert und gekürzt, um potenzielle Wirtsregionen gemäß dem vorherigen Protokoll zu entfernen (55). Vorhergesagte Contigs wurden als viralen Ursprungs betrachtet, wenn sie mindestens eines der drei folgenden Kriterien erfüllten: (1) Contigs enthielten mindestens ein virusspezifisches Kennzeichen-Gen; (2) Contigs hatten VirSorter2-Werte ≥0,95; (3) Die Gesamtzahl der als „unbekannt“ gekennzeichneten Gene (Datenbank egg-NOG v5.0.0) machte ≥80 % der Gesamtzahl der Gene auf dem Gerüst aus. Schließlich wurden alle potenziellen viralen Contigs mit VIBRANT [56] (v1.2.1, Virom-Modus) mit Standardeinstellungen weiter überprüft. Die identifizierten viralen Contigs wurden mit CD-HIT v4.8.1 [57] (Parameter: -c 0,95 -aS 0,85) mit einer durchschnittlichen Nukleotididentität von 95 % und einer Abdeckung von mindestens 85 % geclustert, was zu insgesamt 1297 viralen OTUs führte (von hier). werden als „vOTUs“ bezeichnet). Die längste Sequenz jedes Clusters wurde in nachfolgenden Analysen als repräsentative Sequenz einer bestimmten Virusgruppe verwendet. Die Vollständigkeit viraler Genome wurde mithilfe der CheckV-Pipeline geschätzt. Um die Überlappung zwischen unseren repräsentativen vOTUs und den im IMG/VR v3-Datensatz enthaltenen Viren zu bestimmen (58), verwendeten wir schnelles Genom-Clustering, um die vOTUs unseres Datensatzes zu identifizieren, die 95 % Identität und 85 % Abdeckung mit IMG/VR v3-Viren hatten auf den in CheckV bereitgestellten Skripten (Skript aniclust.py) mit den Parametern „--min_ani 95 --min_qcov 0 --min_tcov 85“.

Die taxonomische Zuordnung viraler Contigs wurde mithilfe von PhaGCN2 auf der Grundlage der neuesten ICTV-Klassifizierungstabellen durchgeführt (59). Referenzviren wurden aus der RefSeq-Virendatenbank (v216, veröffentlicht im Januar 2023) bezogen. Im Falle nicht klassifizierter Viren wurde CAT (60) zur Zuordnung viraler Taxonomien unter Verwendung des Lowest Common Ancestor-Algorithmus gegenüber der NCBI-Nr.-Datenbank verwendet. Nur sehr wenige Kompost-vOTUs (7,7 %) häuften sich mit taxonomisch bekannten Viren, basierend auf den beiden oben genannten Methoden. Die nicht redundanten funktionellen Proteine ​​in viralen Contigs wurden mit VIBRANT auf Basis der Pfam-, dbCAN-, KEGG- und eggNOG-Datenbanken 5.0 mit Standardparametern annotiert (Tabelle S8) [4, 61]. Der Phagen-Lebensstil wurde mithilfe von drei Tools vorhergesagt, darunter VIBRANT (56), PhaTYP (62) und manuell kuratiertes BLAST (25), basierend auf zuvor beschriebenen Methoden (25, 63). Kurz gesagt wurden VIBRANT [56] und manuelles BLAST [25] verwendet, um auf einen gemäßigten Lebensstil zu schließen, indem virale Contigs identifiziert wurden, die Proteine ​​enthielten, die mit Lysogenese assoziiert sind (Transposase, Integrase, Exzisionase, Resolvase und Rekombinase) [74]. Aufgrund der Unvollständigkeit mehrerer viraler Contigs wurde auch eine maschinelle Lernmethode namens PhaTYP [62] verwendet, um den Lebensstil der Phagen vorherzusagen. Das Virus wurde als gemäßigter Phagen eingestuft, wenn durch eines dieser Werkzeuge vorhergesagt wurde, dass es lysogen ist. Darüber hinaus wurden vOTUs, die während der vConTACT2-Clusterbildung mit bekannten gemäßigten Phagen geclustert wurden oder provirale Sequenzen darstellten, als gemäßigt eingestuft [25]. Alle anderen vOTUs wurden als lytisch eingestuft, obwohl das Fehlen temperierter Phagen-assoziierter Proteine ​​auch auf die Unvollständigkeit der viralen Genome zurückzuführen sein könnte.

Die relative Häufigkeit von vOTUs und MAGs in den 12 Metagenom-Datensätzen (vier Probenahmezeitpunkte mit jeweils drei Replikaten) wurde mithilfe der CoverM-Pipeline [4] (v0.61, https://github.com/wwood/CoverM) quantifiziert. Die relativen Häufigkeiten von vOTUs und MAGs wurden basierend auf der Abdeckung kartierter Lesevorgänge im „Contig“- und „Genom“-Modus für vOTUs bzw. MAGs berechnet. Um die relative Häufigkeit jedes vOTU und MAG zu berechnen, wurden qualitätskontrollierte Lesevorgänge von jeweils 12 Kompostmetagenomen auf den Satz von 1297 dereplizierten Virusgenomen oder 228 dereplizierten MAGs mit CoverM-Pipeline unter Verwendung der „rpkm“-Berechnungsmethode (Lesungen pro Kilobase Exon pro) abgebildet Millionen Lesevorgänge zugeordnet). RPKM [63] wird für relative Häufigkeitsvergleiche mit metagenomischen Datensätzen empfohlen, da RPKM die Daten sowohl auf der Grundlage der Sequenztiefe (pro Million Lesevorgänge) als auch der Sequenzlänge (in Kilobasen) normalisiert. Bei Viren wurden Lesevorgänge nach der Qualitätskontrolle zunächst mithilfe des Befehls „make“ in CoverM v0.6.1 viralen Contigs zugeordnet, um BAM-Dateien zu erstellen. Anschließend wurde der Befehl „filter“ verwendet, um Alignments mit geringer Qualität und einer Leseidentität von ≤ 95 % zu entfernen und auszurichten Prozent ≤75 % (Parameter: --percentage_id 0,95 --percentage_aln 0,75). Gefilterte BAM-Dateien wurden als Eingabe in CoverM verwendet, um Abdeckungsprofile über Proben hinweg zu generieren (Parameter: --trim-min 0,10 --trim-max 0,90 --min-read-percent-identity 0,95 --min-read-aligned-percent 0,75). -m gemein). Für MAGs wurde das gleiche Berechnungsprotokoll wie für vOTUs verwendet, außer dass im letzten Schritt der Befehl „genome“ anstelle von „contig“ verwendet wurde. Die Abdeckung von jedem vOTU und MAG wurde als bakterielle und virale Häufigkeitsmatrizen zusammengeführt, die direkt für Häufigkeits- und Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen verwendet wurden (log-transformierte Matrizen wurden für Mantel-Korrelationen verwendet).

Die 1.297 vOTUs wurden mutmaßlich mit 228 bakteriellen Wirts-MAGs unter Verwendung von drei In-silico-Methoden verknüpft [4, 64], wobei Virus-Wirt-Verknüpfungen basierend auf Folgendem vorhergesagt wurden: (1) gemeinsamer genomischer Inhalt zwischen viralen und bakteriellen Wirtsgerüsten (Bitscore ≥ 50, e- Wert < 10−3, Identität ≥ 70 % und passende Länge ≥ 2500 bp [4, 65]); (2) Sequenzähnlichkeit zwischen CRISPR-Spacern zwischen bakteriellen und viralen Gerüsten; (3) Abgleich von vOTU-abgeleiteten tRNA-Sequenzen in MAGs mit tRNAscan (Version 2.0.9, unter Verwendung des allgemeinen bzw. bakteriellen/archealen Modells) und BLAST (95 % Abdeckung und 90 % Sequenzidentität, E-Wert <1e-05). ) nach dem Löschen von Selbsttreffern und Duplikaten [65]. CRISPR-Spacer wurden aus metagenomischen bakteriellen MAG-Contigs mit CRT (Version 1.2) mit Standardparametern gewonnen (66). Extrahierte Spacer-Sequenzen wurden mithilfe von BLASTn mit vOTUs abgeglichen (100 % Nukleotididentität, Fehlpaarung ≤ 1 und E-Wert ≤ 10–5). Da die OGT-Werte von Viren mit Tome v1.1 [48] nicht bestimmt werden konnten, wurden Viren als thermophil eingestuft, wenn sie mit mindestens einem Behälter mit OGT ≥ 50 °C assoziiert waren.

Die zuverlässige Identifizierung potenzieller viraler Hilfsstoffwechselgene (AMG) aus Metagenomen bleibt eine Herausforderung für das Fachgebiet [22, 51]. Ein glaubwürdiges potenzielles AMG muss zwei folgende Merkmale aufweisen [51, 63]: 1) Die potenziellen AMGs müssen zwischen viralen Genen lokalisiert sein, wobei sowohl die Start- als auch die Endregion virale Kennzeichen oder virusähnliche Gene aufweisen; 2) Der AMG-Kandidat muss an einem zellulären Stoffwechselweg beteiligt sein. Basierend auf den oben genannten Prinzipien verwendeten wir automatisierte Annotationstools DRAM-v (Version 1.2.0, Standardparameter), um mögliche AMGs zu identifizieren, kombiniert mit manueller Kuration [67]. Die AMG-Annotationsdatei von DRAM-v wurde unter Verwendung der folgenden Parameter weiter verfeinert: AMGs-Score von 1–3 und AMG-Flag von -M und -F [67]. Die funktionale Annotation von AMGs erfolgte mithilfe von drei Datenbanken: der Genorthologiedatenbank von eggNOG 5.0 (68), der Kohlenhydrat-aktiven Enzymdatenbank (CAZy) (46) (dbCAN2 HMMdb Version 10.0) und der KEGG-Datenbank (69). Wir führten auch eine manuelle Kuration durch, um die Zuverlässigkeit der AMG-Identifizierung zu verbessern, wie zuvor beschrieben [51, 63, 70, 71], indem wir alle potenziell illegitimen AMGs entfernten, die den Genkategorien DNA-bezogener Reaktionen, Nukleotidstoffwechsel, Virusinvasion (d. h. Lysozyme/Endolysine), Modifikation viraler Komponenten (d. h. Glykosyltransferasen, Adenylyltransferasen und Methyltransferasen, die vermutlich an der Modifikation viraler DNA, RNA und Strukturproteine ​​beteiligt sind). Diese Pipeline führte zu 194 hochzuverlässigen AMG-Kandidaten aus 1297 vOTUs. Um den AMG-vermittelten Kohlenstoffstoffwechsel weiter zu untersuchen, wurden Proteinsequenzen aus den zurückgehaltenen Glycosidhydrolasen (GHs) mit Phyre2 im Experten-Batch-Übermittlungsmodus (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/) strukturell modelliert. page.cgi?id=index), um ihre funktionalen Vorhersagen zu bestätigen und aufzulösen [72]. Von diesen GHs wurden diejenigen mit vorhergesagter Sekundärstruktur mit einem Konfidenzwert von 100 % in weiteren Analysen berücksichtigt.

Metatranskriptomische Lesevorgänge wurden über Trimmomatic (Version 0,39) qualitätsgefiltert, wie zuvor beschrieben [4]. Darüber hinaus wurde SortMeRNA (v4.3.4) [73] verwendet, um nicht-kodierende RNA-Sequenzen (tRNA, tmRNA, 5S, 16S, 18S, 23S und 28S rRNA-Sequenzen) aus den metatranskriptomischen Lesevorgängen zu entfernen. Die verbleibenden gesamten mRNA-Reads in 12 Kompost-Metatranskriptomen (vier Probenahmezeitpunkte mit jeweils drei Replikaten) wurden auf 228 MAG- oder 1297 vOTU-Contigs zurückgeführt, um aktive bakterielle und virale Taxa basierend auf der durchschnittlichen Abdeckung von Transkripten pro Genom mithilfe von Minimap2 zu identifizieren [74]. der CoverM-Pipeline (https://github.com/wwood/CoverM). Kurz gesagt wurden metatranskriptomische Datensätze als Eingabe-Reads verwendet, wobei dieselben Mapping-Parameter wie bei der metagenomischen Read-Zuordnung verwendet wurden, mit der Ausnahme, dass die Berechnungsmethode „tpm“ (Transcripts Per Kilobase Per Million Mapped Reads, TPM) gewählt wurde. Die gesamte Aktivität wurde auf der Ebene von vOTUs und MAGs quantifiziert, und Viren und Bakterien wurden als aktiv angesehen, wenn die TPM-Werte für beide Duplikate von zwei von drei biologischen Replikaten größer als 0 waren (TPM-Werte für jedes MAG und vOTU sind in der Ergänzungstabelle angegeben). 4). Da Viren nur ein Contig (eine vOTU) enthielten, galten sie auch dann als aktiv, wenn ein virales Gen TPM-Werte größer als 0 aufwies. Um die Expression annotierter Gene in zusammengesetzten MAGs und vOTUs zu bestimmen, wurden mRNA-Reads einer verketteten Fasta-Datei zugeordnet einschließlich aller Gene von MAG bin oder vOTU unter Verwendung von Hisat2 mit Standardparametern (75). Die Quantifizierung der kartierten Lesevorgänge pro identifiziertem Gen wurde mit der Funktion featureCounts des R Subread-Pakets durchgeführt [76]. Die Transkripthäufigkeit jedes Gens oder Contigs wurde für jede Probentiefe in Transkript pro Million (TPM, Gleichung (1)) umgewandelt.

wobei A = auf Gen/Genlänge (kbp) abgebildete Lesevorgänge.

Da neuere Studien darauf hindeuten, dass RNA-Viren ebenfalls wichtige, aber übersehene Akteure sein könnten, die dem Funktionieren des Ökosystems zugrunde liegen [77,78,79,80], haben wir Veränderungen in ihrer Diversität und Zusammensetzung während der Kompostierung anhand der in früheren Studien beschriebenen Methoden untersucht [78, 79, 81]. Kurz gesagt, wir verwendeten das RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp)-Markengen als Zielgen, um RNA-Viren während der Kompostierung zu untersuchen (insgesamt 12 Metatranskriptomproben, einschließlich vier Zeitpunkten und drei Replikaten). Alle assemblierten Contigs (>1000 bp, kompostierungsphasenspezifische Assemblies) wurden mit der Datenbank verglichen, die alle verfügbaren viralen RdRp-Gensequenzen in NCBI/GenBank (37.441 Gene, heruntergeladen im Februar 2023) und früheren veröffentlichten Studien enthielt (77, 78). unter Verwendung von Diamond BLASTx (Abdeckung ≥ 70 %, E-Wert ≤ 1e-10 und Punktzahl ≥ 70). Sequenzen, die in der RdRp-Datenbank Treffer mit der RdRp-Kerndomäne aufwiesen, wurden als potenzielle RNA-Viren angesehen [80]. Diese Analyse identifizierte 109 Contigs mit dem RdRp-Gen. Diese potenziellen RNA-Virus-Contigs wurden mit CD-HIT unter Verwendung einer durchschnittlichen Nukleotididentität von 95 % über einen Alignment-Anteil von 85 % geclustert, was insgesamt 83 potenzielle RNA-Viren ergab.

Wir analysierten auch das Vorhandensein von ssDNA-Phagen in zusammengesetzten metatranskriptomischen Contigs mit denselben Methoden wie bei anderen Viren (mit Ausnahme des VIBRANT-Tools). Aus den metatranskriptomischen Assemblies wurden insgesamt 68 mutmaßliche dsDNA-Phagen-Contigs (mit Größen > 5 kb) erhalten. Nach der Clusterbildung (95 % Nukleotidähnlichkeit und über 85 % Abdeckung) blieben insgesamt 41 dsDNA virale operative taxonomische Einheiten (dsvOTUs) erhalten. Durch den Vergleich der aus transkriptomischen Daten und metagenomischen Daten abgeleiteten Contigs der Viren konnten nur 7 von 68 dsvOTUs aus den metagenomischen Daten zusammengestellt werden. Dies ist nicht überraschend, da die DNA während der Erstellung der RNA-Bibliothek entfernt wurde und nur sehr wenige DNA-Sequenzen im Transkriptom erhalten blieben.

Die Daten wurden statistisch mit der R-Plattform v 3.6.1 (https://www.r-project.org/) analysiert [82]. Die mikrobiellen Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen (einschließlich Alpha-Index und PCoA) wurden mit veganen und ggplot2-Paketen in R durchgeführt. Die mittleren Gesamtunterschiede über die Probenahmezeit hinweg wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert, gefolgt von mehreren Vergleichen mithilfe des Tukey-HSD-Tests unter Verwendung des p -Wert kleiner als 0,05 als Signifikanzschwelle. Nichtparametrische PERMANOVA (Adonis-Funktion) wurde verwendet, um die Bedeutung von Probenahmezeitpunkten für die Mikrobiomzusammensetzung zu bestimmen. Bei nichtparametrischen Wilcoxon-Signed-Rank- und Adonis-Tests wurde die statistische Signifikanz anhand von 999 Permutationen ermittelt. Die unterschiedliche Genexpression zwischen Metatranskriptomen wurde mithilfe von DESeq2 mit FDR-Korrektur bei p = 0,05 analysiert.

Um die Vielfalt jeder Stichprobe zu bewerten, wurde die Alpha-Diversität (Reichtum, Shannon-Index) mithilfe des Pakets „vegan“ (https://cran.r-project.org/web/packages/vegan) bewertet. Die Beta-Diversität wurde mithilfe der beiden ersten Achsen der Bray-Curtis-Unähnlichkeitsmatrix quantifiziert. Statistische Signifikanzen zwischen Probengruppen wurden mithilfe einer PERMANOVA mit 999 Permutationen getestet.

Ein teilweiser Mantel-Test wurde durchgeführt, um die Korrelation zwischen zwei multivariaten Matrizen zu bewerten und gleichzeitig die möglichen Auswirkungen des Nährstoffumsatzes (Kohlenstoff und Stickstoff) mithilfe des R-Pakets „vegan“ zu kontrollieren. Die Abstände für die vOTU- und MAG-Häufigkeit und den Nährstoffumsatz während der Kompostierung wurden mithilfe der Bray-Curtis-Unähnlichkeitsmatrizen berechnet. Partielle Mantelkorrelationen wurden zwischen allen Distanzmatrizenpaaren für MAGs und vOTUs mit 999 Permutationen für jeden Vergleich berechnet. Die Falscherkennungsrate wurde mit der Benjamini-Hochberg-Methode berechnet.

Um die wichtigsten Prädiktoren zu identifizieren, die den Nährstoffkreislauf während der Kompostierung erklären, verglichen wir den Beitrag der Zusammensetzung der Bakterien- und Virusgemeinschaft (basierend auf Bray-Curtis-Unterschiede) auf DNA- und RNA-Ebene unter Verwendung von Standardparametern der Random Forest (RF)-Analyse [83]. . In diesen RF-Modellen wurde die Bedeutung jedes mikrobiellen Prädiktors (Zusammensetzung der Bakterien- und Virusgemeinschaft auf DNA- und RNA-Ebene) für den Nährstoffumsatz im Kompost bestimmt (Euklidische Distanzunähnlichkeit basierend auf allen physikalisch-chemischen Kompostierungseigenschaften). Um die relative Bedeutung verschiedener Prädiktorvariablen zu beurteilen, haben wir die prozentualen Anstiege des MSE (mittlerer quadratischer Fehler) verglichen, wobei hohe MSE-Prozentwerte auf einen relativ wichtigeren Beitrag bestimmter Prädiktorvariablen hinweisen [84]. Die Signifikanz der Modelle und kreuzvalidierten R2-Werte wurden mit 1000 Permutationen der Antwortvariablen mithilfe des Pakets „A3“ in R bewertet. Die Analyse wurde mit dem Paket „rfPermute“ in R durchgeführt.

Die partielle Pfadmodellierung der kleinsten Quadrate (PLS-PM) wurde eingesetzt, um die direkten und indirekten Auswirkungen verschiedener Arten von Bakterien zu untersuchen (Bray-Curtis-Unähnlichkeit von mesophilen (OGT < 50 °C) und thermophilen MAGs (OGT ≥ 50 °C) und mesophilen und Zusammensetzung der thermophilen Virusgemeinschaft (Bray-Curtis-Unähnlichkeit von vOTUs) und katabolische Aktivität (Metatranskriptomik von MAGs und vOTUs) in Bezug auf den Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf während der Kompostierung [85]. Der Kohlenstoffkreislaufindex wurde als zeitliche Änderung in der Unähnlichkeitsmatrix bestimmt (basierend auf Euklidischer Abstand) für TC, OM, IC, WSC und TOC, während der Stickstoffkreislaufindex auf der zeitlichen Änderung der Unähnlichkeitsmatrix (basierend auf dem euklidischen Abstand) für TN, C/N, WSN, NH4+ und NO3- basierte. Das Finale Das PLS-PM-Modell wurde basierend auf der Goodness of Fit (GoF)-Statistik ausgewählt – einem Maß für die gesamte Vorhersagekraft des Modells. PLS-PM wurde mit R v3.6.1 über das Paket „plspm“ (v 0.4.7) analysiert.

Änderungen der Kompostierungseigenschaften wurden während eines 45-tägigen HTC-Experiments im Originalmaßstab quantifiziert, wobei der Schwerpunkt auf der Temperatur, der Zersetzung organischer Stoffe sowie dem Kohlenstoff- und Stickstoffgehalt lag. Die Temperatur stieg nach 2 Tagen der Fermentation schnell auf etwa 90 °C an und blieb 9 Tage lang über 80 °C („hyperthermophile Phase“), bevor sie am 27. Tag allmählich auf 55 °C („thermophile Phase“) und Umgebungstemperatur abfiel ( „Reifungsphase“, Abb. 1a). Die Zersetzung organischer Substanz (OM) sowie der Kohlenstoff- und Stickstoffumsatz folgten sehr unterschiedlichen Phasen der HTC (Abb. 1a). Im Vergleich zu den anfänglichen Kompostierungsrohstoffen verringerten sich die Gesamtgehalte an Kohlenstoff (TC, F3,23 = 33,6, p < 0,0001) und Stickstoff (TN, F3,23 = 19,8, p < 0,0001) bis zum Ende deutlich um 32 % bzw. 28 % von HTC (Abb. S1a). Ebenso sank der OM-Gehalt, der in der hyperthermophilen Phase die höchste Abbaurate zeigte, von 51,3 % auf 38,7 % (F3,23 = 68,3, p < 0,0001), während die Konzentration an wasserlöslichem Kohlenstoff (WSC, F3,23 = 19,8) sank , p < 0,0001) und wasserlöslicher Stickstoff (WSN, F3,23 = 26,4, p < 0,0001) stiegen während der HCT an und erreichten Spitzenkonzentrationen in der hyperthermophilen Phase (Abb. 1a). Die Abbaurate von OM korrelierte positiv mit Temperatur, WSC und WSN (Abb. S1b), was auf einen effizienten Nährstoffkreislauf während der HTC hinweist.

a Änderungen der Kompostierungseigenschaften während verschiedener Phasen der HTC. S0: Anfangsphase (D0); S1: hyperthermophile Phase (D4 bis D9); S2: thermophile Phase (D15 bis D21); S3: Reifephase (D27 bis D45). Temp: Kompostierungstemperatur; OMDR: Abbaurate organischer Substanz; WSC: wasserlöslicher Kohlenstoff; WSN: wasserlöslicher Stickstoff. b Veränderungen in der bakteriellen (oberes Feld) und viralen (unteres Feld) Gemeinschaftszusammensetzung während verschiedener Phasen der HTC basierend auf den Probenahmezeitpunkten D0, D4, D15 und D27. c Veränderungen im Artenreichtum von Bakterien (oberes Feld) und Virus (unteres Feld) während der HTC. d Veränderungen in der relativen Häufigkeit von Bakterien (oberes Feld; Phyla-Ebene) und der vorhergesagten Häufigkeit viraler Wirtstaxa während der HTC (unteres Feld; basierend auf Metagenom-Lesekartierung; n = 12). In (a) und (c) zeigen die Daten den Mittelwert ± SD mit drei biologischen Replikaten pro Behandlung (n = 3); Unterschiedliche Kleinbuchstaben zwischen den Behandlungen bedeuten signifikante Unterschiede bei p < 0,05. Alle Datensätze basieren auf Metagenomik.

Um Veränderungen im Nährstoffumsatz mit der Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaft zu verknüpfen, haben wir die Diversität und Zusammensetzung der Bakterien- und Virusgemeinschaft während der HTC mithilfe von Metagenom- und Amplikonsequenzierung charakterisiert. Von allen metagenomischen Messwerten machten Bakteriensequenzen zwischen 50 und 60 % aus, während weniger als 1 % den Archaeen und Eukaryoten (Pilzen, Protozoen und Algen) und weniger als 0,1 % den Viren zugeordnet werden konnten. Basierend auf der 16S-rRNA-Gensequenzierung wurden während des HTC mehr als 11 Bakterienstämme (Acidobacteriota, Actinobacteriota, Armatimonadota, Bacteroidota, Chloroflexota, Deinococcota, Gemmatimonadota, Firmicutes, Nitrospirota, Planctomycetota und Proteobacteria) nachgewiesen, darunter Firmicutes, Acidobacteriota, Bacteroidota und Deinococcota und Proteobakterien sind mit einem Anteil von 92,5 % aller Taxa die dominantesten Phyla (Abb. S2a). Obwohl diese Phyla in allen Stadien der HTC durchgängig vorhanden waren, zeigten sie erhebliche Veränderungen in ihrer Häufigkeit (Abb. S2a). Bakteriengemeinschaften wurden basierend auf dem metagenomischen Datensatz weiter analysiert. Die Kompostierungstemperatur hatte signifikante Auswirkungen auf den Bakterienreichtum (F3,8 = 44,1, p < 0,001) und die Zusammensetzung (R2 = 0,89, p < 0,001, PERMANOVA-Test, Abb. 1b, c). Proteobakterien (51,4 %) und Bacteroidota (12,0 %) waren in der Anfangsphase der Kompostierung die dominantesten Phyla, während die relativen Häufigkeiten der thermophilen Thermus- und Planifilum-Gattungen, die zu Firmicutes und Deinococcota gehören, signifikant von 5,3 % am Tag 0 auf 91,4 % am Tag 15 zunahmen ( F3,8 = 25,8, p < 0,001, Abb. 1d). Die Reifungsphase (D27) von HTC war mit einer hohen relativen Häufigkeit von Actinobacteriota, einschließlich der Gattungen Actinomadura und Streptomyces, verbunden (F3,8 = 72,6, p < 0,0001). Sowohl die Häufigkeit bakterieller Taxa (basierend auf der Stammebene) als auch der Reichtum der Gemeinschaft folgten eindeutig den verschiedenen Phasen der HTC-Kompostierung (Abb. 1b, c; qualitativ ähnliche Veränderungen wurden basierend auf der 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung beobachtet, Abb. S2). Die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft (basierend auf dem βNTI-Index aus der Amplikonsequenzierung) korrelierte mit dem Kreislauf von Kohlenstoff und Stickstoff und der Kompostierungstemperatur (alle p < 0,0001, Abb. S3), was auf eine temperaturabhängige, deterministische Zusammensetzung der Kompostgemeinschaft hinweist.

Wir haben uns zunächst auf die Analyse von Veränderungen in DNA-Virusgemeinschaften während der Kompostierung konzentriert. Aus den metagenomischen Assemblies wurden insgesamt 1507 mutmaßliche virale Contigs (mit einer Größe von >5 kb) erhalten. Nach der Clusterbildung (95 % Nukleotidähnlichkeit und über 85 % Abdeckung) blieben insgesamt 1297 virale operative taxonomische Einheiten (vOTUs) erhalten (Tabelle S1), die hauptsächlich zu doppelsträngigen DNA-Viren (97 %) gehörten und als solche vorhergesagt wurden überwiegend lytisch (66,2 %). Die Genomqualität der vOTUs bestand aus 0,7 % hochqualitativen, 2,4 % mittelqualitativen und 85,6 % minderwertigen vOTUs, während die Qualität der restlichen 11,3 % der vOTUs nicht bestimmt werden konnte. Insgesamt wurden 78,6 % der vOTUs in nicht-thermophilen Phasen (D0 und D27) nachgewiesen, während 21,3 % in thermophilen Phasen (D4 und D15, Tabelle S1) auftraten. Nur 7,7 % der vOTUs konnten mit taxonomisch bekannten Viren in der RefSeq-Datenbank (v216, veröffentlicht im Februar 2023) geclustert werden, während nur 35 vOTUs (2,6 %) mit bekannten Viren in der IMG/VR-Datenbank (v3) geclustert wurden, was darauf hindeutet, dass die meisten davon Kompostierungsviren waren neu. Sie gehörten hauptsächlich zu den Stämmen Dividoviricota (88 %) und Uroviricota (2 %) sowie Mesyanzhinovviridae (27,2 %), Herelleviridae (18,2 %), Salasmaviridae (16,4 %), Autographiviridae (5,4 %), Vilmaviridae (5,4 %) und Matshushitaviridae ( 3,6 %) Familien (Tabelle S1 und Abb. S4). Ähnlich wie bei Bakterien folgten der Reichtum (F3,8 = 4,7, p = 0,0359) und die Zusammensetzung (R2 = 0,78, p < 0,001, PERMANOVA-Test) der Virusgemeinschaften verschiedenen Phasen der HTC (Abb. 1d). Während Vilmaviridae (37,8 %) und Autographiviridae (14,5 %) dominante Viren im Kompostrohmaterial waren (D0), sank die Häufigkeit von Vilmaviridae bis zur Reifungsphase signifikant auf 1,5 % (D27; F3,8 = 9,7, p = 0,0047, Abb. S4). Im Gegensatz dazu stieg die relative Häufigkeit der Matshushitaviridae-Familie unter dem Dividoviricota-Stamm (der hauptsächlich aus thermophilen assoziierten Thermus-Phagen besteht) von 1,4 % bei D0 auf 66,3 % bei D15 (F3,8 = 5,7, p = 0,0245, Abb. S4). Da die meisten Viren nicht klassifiziert werden konnten, wurde die Virushäufigkeit auch auf der Grundlage ihrer vorhergesagten Wirtstaxonomie untersucht (siehe Methoden). Die Häufigkeit viraler Taxa folgte der Häufigkeit bakterieller Taxa (Abb. 1d), und beispielsweise nahm die Häufigkeit von Viren, die Deinococcota infizieren, mit steigender Kompostierungstemperatur um D15 deutlich zu. Darüber hinaus korrelierten die Matshushitaviridae-Virushäufigkeiten positiv mit den Wirtshäufigkeiten von Firmicute (R2 = 0,34, p = 0,028) und Deinococcota (R2 = 0,53, p = 0,0042, Abb. S5). Insgesamt korrelierten Änderungen des Reichtums und der Zusammensetzung der Virusgemeinschaft (R2 = 0,50, p = 0,0058) und der Zusammensetzung (Beta-Unähnlichkeit, R2 = 0,71, p < 0,0001) positiv mit Änderungen des Reichtums und der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft (Abb. 2a, b).

Die Beziehung zwischen viralen und bakteriellen Gemeinschaften basierend auf Reichtum (a) und Beta-Diversitätsindizes (b). c Phylogenetischer Baum von MAGs (Phylum-Ebene), gewonnen aus Metagenomen, basierend auf einem verketteten Satz von 120 konservierten bakteriellen Einzelkopie-Markergenen. Die orangefarbenen Kreise stehen für MAG-Linien, bei denen vorhergesagt wurde, dass sie mit Viren infiziert sind, wobei die Anzahl der identifizierten vOTUs in den Kreisen angezeigt wird. Die Baumskala zeigt Nukleotidsubstitutionen pro Stelle. d Positive Korrelation zwischen viraler und vorhergesagter Wirtsbakterienhäufigkeit in allen Kompostierungsproben. e Negative Korrelation zwischen der nachgewiesenen Anzahl aktiver Viren und aktiven Wirtsbakterien in allen Kompostierungsproben. (f) Vorhergesagte Virus-Wirt-Verbindungen zwischen viraler Taxonomie (auf Familienebene) und bakteriellen MAGs während der HTC. Die beiden linken Felder stellen die nach Stamm und Gattung gefärbte Wirts-Taxonomie dar, und die beiden rechten Felder zeigen Viruscluster, die mit Probenahmetagen verbunden sind. Graue Verbindungslinien zeigen Assoziationen zwischen Bakterienwirt (auf Stamm- und Familienebene) und Viren, die mit bestimmten Probenahmezeitpunkten auf der rechten Seite verbunden sind. In (a–e) zeigt der schattierte Bereich das 95 %-Konfidenzintervall um die angepasste Mittellinie.

Um die Virus-Wirt-Dynamik detaillierter zu untersuchen, haben wir prokaryotische metagenomisch zusammengesetzte Genome (MAGs) für Bakterien rekonstruiert, indem wir metagenomische Shotgun-Contigs zusammengefasst haben. Insgesamt konnten aus allen Proben, darunter 513 Bakterien und 2 Archaeen, 515 MAGs mittlerer bis hoher Qualität zusammengestellt werden (mit einer geschätzten Vollständigkeit von ≥ 50 % und einer Kontamination ≤ 10 %). Die Dereplikation innerhalb jedes Zeitpunkts reduzierte die Gesamtzahl der bakteriellen MAGs auf 227 (17 Phyla, Abb. 2c), darunter 180 mesophile (OGT < 50 °C) und 47 thermophile (OGT ≥ 50 °C) MAGs, basierend auf ihren Vorhersagen optimale Wachstumstemperaturen (OGT, Tabelle S2). Die taxonomische Zusammensetzung und Häufigkeit von MAGs auf Stammebene ähnelten den Ergebnissen, die auf 16 S-rRNA-Gensequenzierungsdaten basierten (Abb. S6), was darauf hindeutet, dass MAGs repräsentativ für die gesamte Bakterienvielfalt waren. Um bakterielle MAGs mit Viren zu assoziieren, wurden drei verschiedene In-silico-Ansätze verwendet: Sequenzähnlichkeitsabgleich, CRISPR-Spacer-Verknüpfungen und tRNA-Abgleich zwischen MAGs und vOTUs (siehe Methoden). Wir fanden heraus, dass 21,3 % der Kompost-vOTUs mit mutmaßlichen MAG-Wirten assoziiert waren, basierend auf den oben genannten drei Methoden (Tabelle S3). Von diesen Viren wurden nur 6,8 % vOTUs taxonomisch den Familien Mesyanzhinovviridae (24,0 %) und Herelleviridae (22,0,6 %) zugeordnet. Zu den häufig vorhergesagten Wirten gehörten Actinobacteriota (18,4 % der Virus-Wirt-Paare), Firmicutes (18,05 %), Bacteroidota (17,3 %), Patescibacteria (13,3 %), Chloroflexota (11,2 %), Proteobacteria (7,2 %) und Deinococcota (2,5 %). , die auch während der HTC die am häufigsten vorkommenden Bakterien waren (Abb. 2c – f). Zu den viralen Wirten gehörten auch thermophile Bakterien mit einer vorhergesagten OGT von mehr als 50 °C: Thermus thermophilus (T_bin.227, OGT = 69,8 °C), Planifilum fulgidum (T_bin.201, OGT = 58,9 °C) und Limnochordales (D15-1- Bin.18, OGT = 70,1 °C). Viren mit vorhergesagten Wirten machten 15–33 % der gesamten Virusgemeinschaft aus, und 45 % der mutmaßlichen Wirte waren mit mehr als einem Virus assoziiert, was auf Polyvalenz hinweist (Tabelle S3). Die Häufigkeit von Viren und Bakterien (lineare Regression, R2 = 0,74, p < 0,001) und die Zusammensetzung der Gemeinschaft (Mantel-Statistik r: 0,71, p < 0,001) korrelierten positiv miteinander (Abb. 2d), während die Anzahl der aktiven MAGs und vOTUs korrelierte negativ miteinander (Abb. 2e). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Dynamik der Bakterien- und Virusgemeinschaft während der HTC eng miteinander verbunden war.

Um Veränderungen in der Bakterien-Virus-Dynamik mit der gesamten Funktion der mikrobiellen Gemeinschaft während des HTC zu verknüpfen, haben wir alle Gene, die wir mit dem Unigenes-Ansatz erkennen konnten (2.485.700 Gene) [86], mit Anmerkungen versehen und sie basierend auf der KEGG-Orthologie-Datenbank verschiedenen Funktionskategorien zugeordnet. Insgesamt konnten 38,2 % aller Gene (950.304) annotiert werden, deren Häufigkeit verschiedenen Phasen der HTC folgte. Insbesondere Gene, die mit dem mikrobiellen Stoffwechsel (Kohlenhydratstoffwechsel, Lipidstoffwechsel, Aminosäurestoffwechsel und Stoffwechsel von Cofaktoren und Vitaminen) zusammenhängen, waren in thermophilen Phasen der HTC signifikant (p < 0,05) um 17 % angereichert (Abb. S7a). Im Gegensatz dazu war die relative Häufigkeit von Genen, die mit Stickstoffstoffwechsel, Quorum Sensing und Zweikomponenten-Regulationssystemen verbunden sind, während der thermophilen Phase von HTC signifikant um 19 % (p < 0,05) reduziert (D15, Abb. S7b).

Um herauszufinden, welche Bakterien und Viren während der HTC aktiv waren, kartierten wir metatranskriptomische Lesevorgänge gegen metagenomische Contigs, einschließlich zusammengesetzter MAGs und vOTUs. Ungefähr 74 % der qualitätsgefilterten mRNA-Reads konnten auf metagenomische Assemblies zurückgeführt werden. Die Transkriptionsaktivität bakterieller MAGs folgte sehr unterschiedlichen Phasen der HTC (Abb. 3a). Insbesondere waren mesophile Bakterien in der Anfangsphase relativ aktiver, darunter MAGs der Armatimonadota (34,2 %) und Actinobacteriota (22,5 %), während thermophile Bakterien während der hyperthermophilen Phase (D15) aktiv wurden, darunter Deinococcota (74,0 %) und Firmicutes (22,8 %) (Abb. 3a und Abb. S8). Veränderungen in der Aktivität der Bakteriengemeinschaft (basierend auf der RNA-Häufigkeitsmatrix von MAGs) korrelierten positiv mit mehreren Kompostierungseigenschaften (Abb. S9). Beispielsweise korrelierte die Aktivität mesophiler Bakterien stark mit dem Kohlenstoffkreislauf (Gesamtkohlenstoff- und anorganischer Kohlenstoffgehalt) und dem OM-Abbau (Mantels r = 0,25–0,80, p < 0,05), während die Aktivität thermophiler Bakterien mit der Kompostierungstemperatur und dem Stickstoff verbunden war Radfahren (Mantels r = 0,25–0,60, p < 0,05).

a Boxplots und Heatmap, die Änderungen in der Transkriptionsaktivität von mesophilen (OGT < 50 °C) und thermophilen (OGT > 50 °C) Bakterien (oberes Feld) und 180 mesophilen und 47 thermophilen MAGs (unteres Feld) während der HTC darstellen. b Boxplots und Heatmap, die Veränderungen in der Transkriptionsaktivität von Viren im Zusammenhang mit mesophilen und thermophilen Bakterien (oberes Feld) und einzelnen vOTUs (unteres Feld) während der HTC darstellen. Boxplots und Heatmaps, die Veränderungen in der Transkriptionsaktivität von mesophilen (OGT < 50 °C) und thermophilen (OGT > 50 °C) Bakterien während der HTC darstellen, basierend auf mittleren (oberes Feld) und individuellen (unteres Feld) MAGs (einschließlich 180 mesophiler und 47 thermophile MAGs) in Verbindung mit Kohlenstoff- (CAZyme) (c) und Stickstoffstoffwechselgenen (d). e Boxplot und Heatmap, die Änderungen in der Transkriptionsaktivität von Virus-assoziierten Kohlenstoff-Metabolismusgenen (CAZyme) darstellen, die mit mesophilen MAGs (OGT < 50 °C) verknüpft sind. In allen (a–e) basiert die in Boxplots dargestellte mittlere Transkriptionsaktivität (MAGs und vOTUs) auf Transkripthäufigkeiten (Transkripte pro Million, TPM), normalisiert durch MAG- und vOTU-Häufigkeiten. Boxplots umfassen das 25.–75. Perzentil, Whiskers zeigen die Minimal- und Maximalwerte und die Mittellinie zeigt den Median (Punkte stellen die biologisch unabhängigen Stichproben dar, Sternchen stehen für signifikante Unterschiede (*p < 0,05, **p < 0,01). ns, nein signifikante Unterschiede). Heatmaps zeigen die Transkriptionsaktivität (MAGs oder vOTUs) basierend auf nicht normalisierten Transkripthäufigkeiten (Transkripte pro Million, TPM). In (c und d) umfassen ausgewählte CAZymes GHs, GTs, PLs, CEs, CBMs und AAs. Zu den Stickstoffstoffwechselwegen gehören assimilatorische Nitratreduktion, dissimilatorische Nitratreduktion, Nitrifikation und Stickstofffixierungswege. Weitere Einzelheiten zu den enthaltenen funktionellen Genen finden Sie in den Ergänzungsdaten 6 bzw. 7.

Im Falle von Viren waren 98,5 % der vOTUs aktiv und folgten genau der Kompostierungstemperatur während der HTC (Abb. 3b und Tabelle S4). Von den taxonomisch zugeordneten vOTUs waren Autographiviridae (45,5 %) und Vilmaviridae (20,6 %) zu Beginn der Kompostierung die aktivsten Viren (D0, Abb. S10). Während die Aktivität von Autographiviridae auf 1,3 % sank, stieg die Aktivität von Matshushitaviridae während der hyperthermophilen Phase signifikant auf 90,2 % (Abb. S10). Insgesamt waren mesophile Viren zu Beginn der Kompostierung relativ aktiver und insbesondere das unbekannte Virus NODE_4560_length_5650_cov_2.431093 hatte eine hohe Transkriptionsaktivität (3,5 %) (Abb. 3b, Tabelle S4). Im Gegensatz dazu waren thermophile Viren während der hyperthermophilen (D15) und Reifungsphase (D27) aktiver, wobei das nicht klassifizierte Virus NODE_636_length_12113_cov_2.763359 während der hyperthermophilen Phase eine hohe Transkriptionsaktivität zeigte (Abb. 3b, Tabelle S4). Ähnliche Aktivitätsmuster wurden bei Viren beobachtet, die nur anhand ihrer vorhergesagten Wirtstaxa klassifiziert werden konnten (Abb. S10). Die Aktivität mesophiler Viren korrelierte nur mit dem Kohlenstoffkreislauf (TC und IC) und dem OM-Abbau (Mantels r = 0,5–0,8, p < 0,05, Abb. S9), während die Aktivität thermophiler Viren signifikant mit der Kompostierungstemperatur und dem Kohlenstoff assoziiert war und Stickstoffkreislauf (Mantels r = 0,25–0,50, p <0,05, Abb. S9). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl die bakterielle als auch die virale Aktivität mit dem Nährstoffkreislauf während der HTC verbunden waren.

Um die Auswirkungen von Viren und Bakterien auf den Nährstoffkreislauf auf funktioneller Ebene zu verstehen, haben wir die Expressionsdynamik katabolischer Gene untersucht, die sowohl von Bakterien als auch von Viren getragen werden. Alle bakteriellen MAGs (227) kodierten für essentielle Stoffwechselgene (Tabelle S5). Insbesondere kohlenhydrataktive Enzyme (CAZymes; durchschnittlich 117 und 89 Gene pro MAG für Mesophile bzw. Thermophile), einschließlich Glycosidhydrolasen (GHs), Glycosyltransferasen (GTs), Polysaccharidlyasen (PLs), Kohlenhydratesterasen (CEs), Kohlenhydratbindende Module (CBMs) und Hilfsaktivitäten (AAs), was auf ihre Bedeutung beim Abbau von Polysacchariden hinweist. Außerdem wurden in allen MAGs Proteinasegene nachgewiesen (durchschnittlich 52,1 bzw. 46,3 Gene pro mesophilem bzw. thermophilem MAG), während 70,6 % der MAGs (2,6 bzw. 0,89 Gene pro mesophilem bzw. thermophilem MAG) Gene enthielten, die mit der Denitrifikation in Zusammenhang stehen (53,7 %), dissimilatorische Nitratreduktion (44,4 %) und Stickstofffixierung (3,5 %). Die Expression der meisten dieser Gene folgte verschiedenen Phasen der HTC (Abb. 3c – e). Insbesondere wurden Gene für den Kohlenhydratstoffwechsel (CAZymes, F3.8 = 37,7, p < 0,0001) von Thermophilen während der thermophilen Phasen von HTC (D4 und D15, Abb. 3c) exprimiert, während Gene für den Stickstoffstoffwechsel (F3.8 = 26,1, p < 0,0001) exprimiert wurden = 0,00017) wurden von mesophilen Bakterien in der Anfangsphase der Kompostierung exprimiert (Abb. 3d). Die Transkriptionsaktivität von CAZymes und Stickstoffstoffwechselgenen durch thermophile und mesophile MAGs war positiv mit dem Nährstoffumsatz während des HTC assoziiert (Mantel-Test, jeweils p < 0,05).

Wir verglichen auch die Häufigkeit und Aktivität von viruskodierten zusätzlichen Stoffwechselgenen (AMGs) für den Nährstoffkreislauf. Etwa 4 % der annotierten viralen ORFs waren mit dem Kohlenhydrattransport und -stoffwechsel sowie dem Aminosäuretransport und -stoffwechsel verbunden (Abb. S11). Die Identifizierung viraler AMGs wurde mithilfe von DRAM-v und manueller Kuration weiter untersucht. Insgesamt 90 mutmaßliche AMGs wurden in 75 mesophilen Phagen (verknüpft mit mesophilen Wirten) gefunden, die die KEGG-Kategorien Kohlenhydratstoffwechsel, Aminosäurestoffwechsel und Phosphorstoffwechsel repräsentieren (Tabelle S6). Insgesamt 34 mutmaßliche AMGs gehörten zu 10 CAZyme-Familien, die am Abbau von Polysaccharidverbindungen wie Hemicellulose und Chitin beteiligt sind (Abb. 3e und Tabelle S6). Darüber hinaus waren 14 AMGs mit dem Peptidase- und Aminosäurestoffwechsel verbunden und diese AMGs waren auf 14 viralen Contigs vorhanden. Darüber hinaus wurden zwei mutmaßliche AMGs, die am Phosphorstoffwechsel beteiligt sind (z. B. das durch Phosphatmangel induzierbare Protein PhoH, alkalische Phosphatase D phoD), auf 10 viralen Contigs nachgewiesen (Tabelle S6). Zur Unterstützung früherer Analysen wurden in keinem der viralen Contigs AMGs gefunden, die mit dem anorganischen Stickstoffstoffwechsel in Zusammenhang stehen. Fast alle identifizierten AMGs wurden während der Kompostierung exprimiert (99,5 %), was auf ihre Bedeutung beim Abbau von Kohlenhydraten und Exopolysacchariden hinweist (Abb. S12). Während das Expressionsniveau der gesamten AMGs während der thermophilen Phase signifikant abnahm (Abb. S13a, F3,8 = 7,7, p = 0,009), nahm die Aktivität von CAZyme signifikant ab (Abb. 3e, F3,8 = 9,4, p = 0,0053). . Infolgedessen korrelierte die virale CAZyme-Aktivität positiv mit dem Kohlenstoffkreislauf während der HTC (R2 = 0,55, p < 0,0001), während kein signifikanter Zusammenhang mit dem Stickstoffkreislauf beobachtet wurde (R2 = 0,14, p = 0,15, Abb. S13b). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass von mesophilen Viren kodierte AMGs zum Abbau komplexer Kohlenhydrate während der nicht-thermophilen Phase der Kompostierung beitrugen.

Wir untersuchten, ob Viren die bakterielle Katabolaktivität durch Top-Down-Dichteregulierung ihrer Wirte auf der Grundlage der linienspezifischen Virus-Wirt-Verhältnisse (VHR; geschätzt anhand von MAG- und vOTU-Daten) beeinflusst haben könnten. Insgesamt übertraf die Virushäufigkeit deutlich die Bakterienhäufigkeit, und die mittlere VHR aller Virus-Wirt-Linien zeigte einen deutlichen Anstieg in thermophilen Phasen (im Bereich von 73,6 bis 190,1; F3,8 = 9,0, p = 0,006, Abb. S14a). Die höchsten VHRs wurden bei Deinococcota am Tag 15 beobachtet, gefolgt von Firmicutes am Tag 27, und die Dynamik der VHRs folgte Änderungen der Kompostierungstemperatur (Abb. 4a). Die zwölf dominantesten mesophilen und thermophilen MAGs (jeweils sechs), deren Häufigkeit 9,1–69,7 % aller MAGs während der HTC ausmachte, wurden ausgewählt, um die Top-Down-Regulierung der Bakteriendichte durch ihre Viren zu untersuchen (Abb. 4b). Die relativen bakteriellen und viralen Häufigkeiten waren während der HTC eng gekoppelt (R2 = 0,79 und R2 = 0,87, p < 0,001) (Abb. 4c), während sowohl die Aktivität (R2 = 0,93 und R2 = 0,96, p < 0,001) als auch die Häufigkeiten ( R2 = 0,79 und R2 = 0,87, p < 0,001) der thermophilen und mesophilen MAGs korrelierten positiv mit ihrer Virushäufigkeit und -aktivität (Abb. 4e). Die relative Häufigkeit und Aktivität mesophiler und thermophiler Bakterien und Viren korrelierte jedoch negativ miteinander und zeigte eine klare mikrobielle Abfolge während der HTC (Abb. 4d – f). Infolgedessen stieg die mittlere VHR von thermophilen MAGs mit der Kompostierungstemperatur (insbesondere für Thermus thermophilus, T_bin.227, D15; F3,8 = 5,7, p = 0,022), während die VHRs von mesophilen MAGs bei Nichtkompostierung eindeutig am höchsten waren -thermophile Phasen (D0 und D27; F3,8 = 5,5, p = 0,023, Abb. S14b). Darüber hinaus korrelierten Änderungen der VHRs positiv mit der Kompostierungstemperatur (R2 = 0,63, p = 0,0012), dem WSC (R2 = 0,31, p = 0,034), dem WSN (R2 = 0,41, p = 0,015) und der OM-Abbaurate (R2 = 0,56, p = 0,0056, Abb. 4g), was darauf hindeutet, dass Viren den Nährstoffkreislauf durch Top-Down-Dichteregulierung der Wirtsbakterien während der HTC steigerten.

eine Heatmap, die Änderungen in den mittleren Virus-Wirt-Häufigkeitsverhältnissen (VHRs) basierend auf allen MAGs und vOTUs, gruppiert nach der vorhergesagten bakteriellen Taxonomie des Wirts, über vier Probenahmezeitpunkte (D0, D4, D15, D27) während der HTC zeigt. b Veränderungen in der relativen Häufigkeit dominanter mesophiler (linkes Feld) und thermophiler (rechtes Feld) MAGs (oberes Feld) und der damit verbundenen Viren (untere Felder; vOTUs) während der HTC. Verknüpfte MAGs und vOTUs werden mit denselben Farben angezeigt. c Positive Beziehungen zwischen dominanten mesophilen und thermophilen MAGs und ihren Viren basierend auf der relativen Häufigkeit. d Negative Beziehungen zwischen der relativen Häufigkeit dominanter mesophiler und thermophiler Viren mit mesophilen bzw. thermophilen MAGs. e Positive Beziehungen zwischen dominanten mesophilen und thermophilen MAGs und ihren Viren basierend auf Metatranskriptomdaten (Transkriptionsaktivität basierend auf nicht normalisierten Transkripten pro Million Lesevorgänge (TPM)). f Negative Beziehungen zwischen der relativen Aktivität dominanter mesophiler und thermophiler Viren mit mesophilen bzw. thermophilen MAGs. g Signifikante positive Korrelationen zwischen den gesamten VHRs und Änderungen der Kompostierungseigenschaften während der HTC. Der schattierte Bereich zeigt das 95 %-Konfidenzintervall um die angepasste Mittellinie. In allen Panels (außer a und b) zeigen die Daten Mittelwerte von drei biologischen Replikaten pro Behandlung (n = 3).

Es wurden mehrere Regressionsmodelle erstellt, um Veränderungen im Nährstoffkreislauf (Vergleich der Unähnlichkeitsmatrizen auf der Grundlage aller Kompostierungseigenschaften im Zeitverlauf) mit der relativen Aktivität der Bakterien- und Virusgemeinschaft (Änderungen der Unähnlichkeitsmatrizen im Zeitverlauf auf der Grundlage von Metatranskriptomen) zu erklären. Die Aktivität von Bakterien- und Virusgemeinschaften (basierend auf MAGs und vOTUs) erklärte 45,3 % der Gesamtvarianz im Nährstoffumsatz. Viren zeigten im Vergleich zu Bakterien einen relativ größeren Beitrag (Abb. 5a), was beim Kohlenstoffkreislauf besonders deutlich wurde, während die bakterielle Aktivität stärker mit dem Stickstoffkreislauf verbunden war (Abb. S15). Die Aktivität von MAGs (R2 = 0,21, p < 0,001) und vOTUs (R2 = 0,52, p < 0,001) korrelierte positiv mit Veränderungen im Nährstoffkreislauf (Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass Nährstoffumsatz und bakterielle und virale Aktivitäten während der HTC gekoppelt waren . Um die relative Bedeutung mesophiler und thermophiler Bakterien und Viren für den Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf weiter zu entschlüsseln, wurden partielle Kleinste-Quadrate-Pfad-Modelle (PLS-PM) erstellt. Wir fanden heraus, dass die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft positiv mit der bakteriellen und viralen Aktivität assoziiert war (Abb. 5c), während thermophile Bakterien einen negativen Zusammenhang mit mesophilen Bakterien hatten, wie durch die beobachtete Abfolge der mikrobiellen Gemeinschaft während der HTC vorhergesagt. Darüber hinaus waren sowohl mesophile als auch thermophile Viren positiv mit ihren Wirtsbakterien assoziiert, was auf eine enge Kopplung der Virus-Bakterien-Dynamik während der HTC hindeutet (Abb. 5c). Im Einklang mit früheren Analysen waren mesophile und thermophile Bakterien positiv mit dem Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf assoziiert, wobei Mesophile relativ stärkere Effekte mit Stickstoff und Thermophile stärkere Effekte mit Kohlenstoff zeigten (Abb. 5c). Im Gegensatz dazu waren nur mesophile Viren mit dem Kohlenstoffkreislauf verbunden, während thermophile Viren keinen signifikanten Zusammenhang mit dem Nährstoffumsatz hatten. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl mesophile als auch thermophile Viren den Nährstoffkreislauf vorantreiben, indem sie die bakterielle Biomasse und Aktivität während der HTC regulieren.

a Prozentualer Anstieg des MSE (mittlerer quadratischer Fehler), der die Bedeutung viraler (vOTU) und bakterieller (MAG) Gemeinschaften bei der Erklärung der Variation im Nährstoffkreislauf während der HTC abschätzt (höhere MSE-%-Werte deuten auf eine erhöhte Bedeutung eines bestimmten Prädiktors hin). Für jeden Baum wurde ein zufälliges Maß für die mittlere Prädiktorbedeutung des Waldes berechnet und über den Wald (5000 Bäume) gemittelt. b Signifikante nichtlineare Korrelationen zwischen bakterieller (schwarze Linie) und viraler (blaue Linie) Gemeinschaftsaktivität mit dem Nährstoffumsatz (basierend auf allen biogeochemischen Parametern) während der HTC basierend auf metatranskriptomischen Datensätzen. c Partielles Pfadmodell der kleinsten Quadrate (PLS-PM), das die relative Bedeutung verschiedener Faktoren vergleicht, die den Nährstoffkreislauf während der HTC erklären. PLS-PM beschreibt die Beziehungen zwischen viralen und bakteriellen Gemeinschaften (Beta-Unähnlichkeit basierend auf mesophilen und thermophilen MAGs oder vOTU), viraler und kataboler MAG-Aktivität. Die Stärken der Pfadkoeffizienten werden als Pfeilbreite und Zahlen daneben angezeigt, während die Farben Blau, Rot und Grau negative, positive bzw. nicht signifikante Effekte anzeigen. Pfadkoeffizienten und Bestimmtheitsmaße (R2) wurden nach 999 Bootstraps berechnet und Signifikanzniveaus werden angegeben, wenn p < 0,05. In (b) stellt die graue Wolke ein 95 %-Konfidenzintervall um die vorhergesagten Werte dar. d Schematische Darstellung, die die Beziehungen zwischen mesophilen und thermophilen Bakterien und ihren Viren in Bezug auf den Nährstoffkreislauf während der HTC beschreibt.

Da neuere Studien darauf hindeuten, dass RNA-Viren ebenfalls wichtige, aber übersehene Akteure sein könnten, die der Funktionsweise des Ökosystems zugrunde liegen [77,78,79,80], haben wir das Kennzeichengen der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRP) als Zielgen zur Untersuchung verwendet Diversität und Zusammensetzung von RNA-Viren bei der Kompostierung. Ungefähr 0,23 % der qualitätsgefilterten mRNA-Reads konnten auf diese RNA-Virus-Contigs zurückgeführt werden (Abb. S16a), was darauf hindeutet, dass RNA-Viren im Metatranskriptom nur eine sehr geringe Häufigkeit aufwiesen. Von diesen 86 potenziellen RNA-Viren konnten 26 mit taxonomisch bekannten Viren in der viralen RefSeq-Datenbank (v216) geclustert werden. Sie gehörten hauptsächlich zu vier Stämmen: Kitrinoviricota (69,2 %), Negarnaviricota (11,5 %), Pisuviricota (11,5 %) und Lenarviricota (7,6 %) (Abb. S16b). Mehr als 50 % der Viren gehörten zur Familie der Virgaviridae, die hauptsächlich aus Pflanzenviren besteht, und nur zwei Viren gehörten zur Familie der Fiersviridae, die mit Bakterien in Verbindung gebracht wurden (Abb. S16c) [87]. Die meisten dieser RNA-Viren (83 %) waren in der Anfangs- und Reifephase der Kompostierung vorhanden, und nur wenige RNA-Phagen (17 %) wurden in Proben nachgewiesen, die während der thermophilen Phase (D4 und D15) gesammelt wurden. Dies kann auf die Hitzeempfindlichkeit von RNA-Viren zurückzuführen sein [88]. Dies wird durch die Häufigkeit von RNA-Viren (basierend auf der Kartierung von RNA-Sequenzierungs-Reads zu RdRP-tragenden Contigs unter Verwendung von coverM (v0.61, https://github.com/wwood/CoverM)) nach sehr unterschiedlichen Phasen der Kompostierung bewiesen (Abb. S16d, e), wobei die meisten RNA-Viren in der Anfangs- und Reifungsphase der Kompostierung eine hohe Häufigkeit aufweisen, während sie in der thermophilen Phase nahezu verschwinden. Wir haben auch das Vorhandensein von dsDNA-Phagen im metatranskriptomischen Datensatz mit denselben Methoden wie bei der Metagenomik analysiert (mit Ausnahme des VIBRANT-Tools). ). Aus den metatranskriptomischen Assemblierungen wurden insgesamt 68 mutmaßliche dsDNA-Phagen-Contigs (mit Größen > 5 kb) erhalten. Nach der Clusterbildung (95 % Nukleotidähnlichkeit und über 85 % Abdeckung) wurden insgesamt 41 dsDNA-Viren zurückgehalten. Durch Vergleich der dsDNA-Viren-Contigs, die aus transkriptomischen und metagenomischen Daten abgeleitet wurden, konnten 89 % der Viren (61 von 68) sowohl aus transkriptomischen als auch metagenomischen Daten zusammengestellt werden, was darauf hindeutet, dass nur sehr wenige dsDNA-Viren ausschließlich im metatranskriptomischen Datensatz vorkommen. Infolgedessen korrelierte die Häufigkeit der RNA-Virusgemeinschaft (basierend auf der Beta-Unähnlichkeit der Häufigkeitsmatrix) nicht mit Änderungen der Kompostierungseigenschaften (Mantel-Statistik r = 0,0173, p = 0,35), was darauf hindeutet, dass sie nicht zum Nährstoffkreislauf beitrugen während der Kompostierung.

Hier untersuchten wir die Rolle von Viren im Nährstoffkreislauf während der hyperthermophilen Kompostierung anhand replizierter und zeitlich abgetasteter Metagenomik- und Metatranskriptomik-Datensätze. Wir fanden heraus, dass die Dynamik der Bakterien- und Virusgemeinschaft eng miteinander verbunden war und verschiedenen Phasen der HTC und des Abbaus organischer Substanz folgte. Während mesophile Viren durch die Kodierung von AMGs, die mit dem Kohlenstoffkreislauf in Verbindung stehen, am Nährstoffkreislauf beteiligt waren, spielten thermophile Viren nur eine indirekte Rolle über die Top-Down-Regulierung der thermophilen Bakteriendichten. Der Nährstoffumsatz korrelierte positiv mit dem Virus-Wirt-Verhältnis, was darauf hindeutet, dass die relative Virushäufigkeit als Indikator für die Funktion des Ökosystems verwendet werden könnte (Abb. 5d). Diese Effekte wurden durch DNA-Viren verursacht, da RNA-Viren hauptsächlich mit Eukaryoten assoziiert waren und nicht mit dem Nährstoffkreislauf während der Kompostierung korrelierten. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die DNA-Viren mit dem Nährstoffumsatz in terrestrischen Ökosystemen in Verbindung bringen [4, 10, 89] und unterstreichen die Rolle der Virusvielfalt und -aktivität für terrestrische biogeochemische Kreisläufe.

Sowohl die Bakterien- als auch die Virusgemeinschaft folgten sehr unterschiedlichen Phasen der Kompostierung, wobei Mesophile und Thermophile die nicht-thermophilen bzw. thermophilen Phasen dominierten. Darüber hinaus zeigten Viren selbst während der hyperthermophilen Phase (>90 °C) eine hohe Aktivität und übertrafen die Bakterienhäufigkeit hinsichtlich des Virus-Wirt-Häufigkeitsverhältnisses durchweg. Mesophile und thermophile Bakterien und ihre Viren zeigten eine klare Abfolge mikrobieller Gemeinschaften, wobei die Anfangsphase der Kompostierung von Mesophilen dominiert wurde, die später durch Thermophile und schließlich gegen Ende des HTC durch Mesophile ersetzt wurden. Obwohl in früheren Kompostierungsexperimenten eine ähnliche Zusammensetzungsabfolge von Bakterien- und Pilzgemeinschaften beobachtet wurde [19, 90], ist dies der erste Beweis dafür, dass Viren während der HTC auch die ökologische Abfolge in mikrobiellen Gemeinschaften vorantreiben können. Diese Ergebnisse weisen auch auf die „Kill-the-Winner“-Hypothese hin, bei der Viren auf die am häufigsten vorkommende Gruppe von Wirtsbakterien abzielen und diese regulieren, wodurch die Dominanzeffekte verringert und die Konkurrenz zwischen verschiedenen Bakterientaxa ausgeglichen werden [4, 89]. Eine solche Dynamik könnte die beobachtete gemeinschaftliche Verschiebung zwischen thermophilen und Reifungsphasen von HTC erklären, wobei thermophile Viren wahrscheinlich die Häufigkeit thermophiler Bakterien verringerten und mesophile Bakterien und ihre Phagen entstehen ließen. Beispielsweise spielen die Bakteriengattungen Thermus und Planifilum eine wichtige Rolle bei der Wärmeerzeugung während der HTC [17], und es wurden mehrere lytische Phagen identifiziert, die Thermus thermophilus (T_bin.227) und Planifilum fulgidum (T_bin.201) infizierten, darunter fünf potenziell neuartige Thermus-Viren hatte eine Genomgröße von etwa 5 kbp, ähnlich dem hyperthermophilen Phagen φOH3, der aus der heißen Quelle von Obama isoliert wurde [91]. Während vorhergesagt wurde, dass 61 % der nachgewiesenen Phagen lytisch seien, ist es möglich, dass einige der Korrelationen zwischen bakteriellen und viralen Taxa auch durch lysogene Phagen oder Prophagen verursacht wurden, da ungefilterte DNA-Proben für die Metagenomik verwendet wurden. Infolgedessen unterschätzt unser Datensatz wahrscheinlich die Phagendiversität und die Phagenanreicherung (92) sollte in zukünftigen Studien verwendet werden. Darüber hinaus sollten zukünftige Arbeiten auch die potenzielle Rolle von RNA-Viren für HTC berücksichtigen, die wir nicht im Detail untersucht haben, da Kompost-assoziierte Bakterien am häufigsten mit DNA-Viren assoziiert sind [19]. Dennoch deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass ein kleiner Teil der thermophilen Viren eine Schlüsselrolle bei der mikrobiellen Aktivität während der thermophilen Phase der HTC spielte, was darauf hindeutet, dass die Funktion des Kompostökosystems zumindest zeitweise von mikrobiellen Gemeinschaften mit geringer Diversität bestimmt wurde. Terrestrische Phagen könnten daher über einen „viralen Shunt“, ähnlich wie marine Phagen, wichtige Treiber des biogeochemischen Kreislaufs in Bodenökosystemen sein [11, 93].

Virale und bakterielle Aktivitäten korrelierten ebenfalls positiv miteinander, und das Virus-Wirt-Verhältnis korrelierte positiv mit Veränderungen im Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf. Während sowohl mesophile als auch thermophile Bakterien aktiv Gene exprimierten, die mit dem Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf verbunden sind, codierten nur mesophile Viren AMGs, die mit dem Kohlenstoffstoffwechsel in Zusammenhang stehen, während bei thermophilen Viren keine mit dem Stoffwechsel in Zusammenhang stehenden AMGs gefunden wurden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die in Meeres- und Bodenökosystemen durchgeführt wurden und in denen eine Vielzahl von AMGs identifiziert wurden, die mit dem Stickstoffstoffwechsel [94], dem Kohlenstoffstoffwechsel [95], dem Phosphatstoffwechsel [96] und dem Schwefelkreislauf [97] in Zusammenhang stehen mesophile Viren. Während jedoch kohlenstoffgebundene virale AMGs häufig in verschiedenen Umgebungen nachgewiesen werden [4, 14, 27], wurden virale AMGs im Zusammenhang mit dem Stickstoffkreislauf seltener beobachtet [94] und wurden in unserer Studie auch nicht gefunden. Alle kohlenstoffassoziierten viralen AMGs waren kohlenhydrataktive Enzyme (CAZymes) und ihre Transkriptionsaktivität korrelierte signifikant mit dem Kohlenstoffumsatz während der HTC. Eine mögliche Erklärung für die relativ höhere Prävalenz kohlenstoffassoziierter viraler AMGs besteht darin, dass sie den Wirtsbakterien möglicherweise mehr Vorteile bieten, da die Kompostierungsmatrix viel organischen Kohlenstoff enthält [16, 98]. Keine CAZymes wurden von thermophilen Viren kodiert. Ein Grund dafür könnte sein, dass thermophile Viren sich angepasst haben, um nicht-stoffwechselbezogene AMGs zu kodieren, um das Überleben von Bakterien und ihr eigenes in stressigen Umgebungen zu verbessern [3, 14]. Dies wird dadurch gestützt, dass viele thermophile AMGs mit dem Aminosäure- und Nukleotidstoffwechsel in Verbindung gebracht wurden und ihre Transkriptionsaktivität während der thermophilen Phase signifikant erhöht war. Trotz unterschiedlicher Auswirkungen auf den Stoffwechsel spielten beide Arten von Viren eine indirekte Rolle im Nährstoffkreislauf, indem sie die Bakterienhäufigkeit und die katabolische Aktivität durch eine Top-Down-Dichtekontrolle regulierten. Es bedarf jedoch noch weiterer Arbeit, um die Funktionsweise entdeckter viraler AMGs in Zukunft direkt zu validieren. Da nur ein sehr kleiner Teil der vOTUs von hoher Qualität war, hat unsere Analyse wahrscheinlich die funktionelle Vielfalt und den Gengehalt von Viren unterschätzt. Schließlich haben wir unseren Metatranskriptomik-Datensatz verwendet, um die mögliche Rolle von RNA-Viren bei der Kompostierung zu untersuchen. Die meisten der nachgewiesenen RNA-Viren (82 %) waren mit eukaryotischen Wirten assoziiert und wiesen während der hyperthermophilen Phase der Kompostierung eine geringe relative Häufigkeit auf. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die darauf hindeuten, dass RNA-Viren hauptsächlich eukaryotische Wirte haben [77] und dass der Nährstoffkreislauf während der Kompostierung hauptsächlich von prokaryotischen Organismen gesteuert wird [19, 21]. RNA-Viren spielten daher wahrscheinlich eine kleine Rolle im Nährstoffkreislauf während der HTC.

Zusammenfassend liefert diese Studie Belege für die Bedeutung von Viren in terrestrischen biochemischen Kreisläufen und im Nährstoffumsatz, insbesondere in thermophilen Extremumgebungen. Ein Großteil der entdeckten viralen Diversität fehlte in Referenzsequenzdatenbanken, was die kontinuierliche Entdeckung neuer viraler Diversität und ihrer Rolle in mikrobiellen Ökosystemen unterstreicht. Ein Grund dafür könnte sein, dass die HTC-Umgebung sehr spezifisch für bakterielle und virale Taxa ist, die in anderen terrestrischen oder aquatischen Ökosystemen nicht vorkommen. Virale AMGs üben nicht nur eine starke Top-Down-Regulierung aus und fördern die Abfolge mikrobieller Gemeinschaften zwischen mesophilen und thermophilen Bakterien, sondern sind auch mit dem Kohlenstoffkreislauf während der mesophilen Phasen der Kompostierung verbunden. Darüber hinaus übertraf die Virushäufigkeit häufig die Bakterienhäufigkeit, und hohe Spitzenwerte des Virus-Wirt-Verhältnisses waren mit einem effizienten Abbau organischer Substanz verbunden. Die relative Virushäufigkeit könnte daher möglicherweise als Indikator für einen effizienten Nährstoffkreislauf und die Funktion mikrobieller Ökosysteme verwendet werden, um die Produktivität biotechnologischer und landwirtschaftlicher Systeme zu optimieren.

Rohe Lesedaten, die in dieser Studie sowohl aus der Amplikon- als auch der Shotgun-Sequenzierung generiert wurden, wurden bei der NCBI SRA (PRJNA861164, PRJNA861429 und PRJNA861433) hinterlegt und sind öffentlich verfügbar. Die Zugangsnummern des Short Reads-Archivs für einzelne Lesevorgänge sind in den Zusatzdaten 7 aufgeführt. Alle in dieser Studie verwendeten zusammengesetzten viralen und bakteriellen Genome und R-Codes sind bei Zenodo verfügbar (https://zenodo.org/record/7397132#). Die Autoren erklären, dass die anderen Hauptdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in diesem Artikel und in den ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind.

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Diese Arbeit wurde vom Laboratory of Lingnan Modern Agriculture Project (NT2021010), der National Natural Science Foundation of China (42277357), der Outstanding Youth Science Foundation der Provinz Fujian (2022J06016) und den Joint Funds der National Natural Science Foundation of China unterstützt ( U21A20295). V-PF wird von der Royal Society (Zuschussnummern RSG\R1\180213 und CHL\R1\180031) und gemeinsam durch einen Zuschuss von UKRI, Defra und der schottischen Regierung im Rahmen des Strategic Priorities Fund Plant Bacterial Diseases Program finanziert ( BB/T010606/1).

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Helsinki, einschließlich des Zentralkrankenhauses der Universität Helsinki.

Fujian Provincial Key Laboratory of Soil Environmental Health and Regulation, College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002, China

Hanpeng Liao, Chen Liu, Chaofan Ai, Tian Gao, Qiu-E Yang und Shungui Zhou

Guangdong-Labor für moderne Lingnan-Landwirtschaft, Guangzhou, 510642, China

Hanpeng Liao und Shungui Zhou

Institut für Öko-Umwelt- und Bodenwissenschaften, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou, 510650, China

Zhen Yu

School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510275, China

Shaoming Gao

Fachbereich Biologie, University of York, Wentworth Way, YO10 5DD, York, Großbritannien

Ville-Petri Friman

Abteilung für Mikrobiologie, Universität Helsinki, Helsinki, 00014, Finnland

Ville-Petri Friman

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HP, CL, CF, YZ, SM und GT analysierten die meisten Laborexperimentdaten und HP und CL führten und analysierten die meisten Kompostierungsexperimentdaten. HL und CL führten die meisten statistischen Analysen durch. VPF und HP entwarfen die Experimente, steuerten intellektuellen Input bei und halfen bei der Analyse der Sequenzierungsdaten. HL und VPF haben das Manuskript mit Hilfe aller Co-Autoren verfasst. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript. HP und SZ betreuten die Studie.

Korrespondenz mit Shungui Zhou oder Ville-Petri Friman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liao, H., Liu, C., Ai, C. et al. Mesophile und thermophile Viren werden mit dem Nährstoffkreislauf während der hyperthermophilen Kompostierung in Verbindung gebracht. ISME J 17, 916–930 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01404-1

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Eingegangen: 05. Oktober 2022

Überarbeitet: 20. März 2023

Angenommen: 22. März 2023

Veröffentlicht: 08. April 2023

Ausgabedatum: Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01404-1

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